Nat Commun | 李墨课题组通过花菁染料修饰ssODN大幅提升CRISPR HDR效率 ...

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自问世以来，CRISPR-Cas9基因编辑技术已深刻改变生命科学研究与基因治疗的发展进程。然而，如何实现精准基因组编辑，即利用同源定向修复（homology-directed repair，HDR）通路将预期的遗传改变准确引入基因组，仍面临编辑效率低和细胞毒性高两大瓶颈。尤其在人类多能干细胞、类器官及类囊胚等高度敏感的模型中，这些问题更为突出，已成为制约精准基因编辑技术进一步发展和应用的重要科学挑战。
近日，沙特阿卜杜拉国王科技大学（KAUST）的李墨教授和Niveen Khashab教授团队在Nature Communications发表题为Cyanine-modified ssODNs enhance CRISPR-Cas9 HDR in stem cell embryo models via chromatin and chemical modulation的研究论文。他们发现，将一种名为Cy5的花菁染料连接到单链DNA修复模板的5'末端（5'Cy5-ssODNs），即可显著提升HDR效率（最高8倍），并赋予被编辑细胞2至3倍的存活优势。这一发现为精准基因编辑提供了一种极简且生物相容性优异的通用型解决方案。


该研究系统首先系统比较了不同 ssODN 末端修饰对 HDR 效率的影响，涵盖 5′端 、3′端单修饰和5‘-3’双端修饰，修饰基团包括三种花菁染料Cy3、Cy5、Cy5.5及非花菁染料 ATTO532，同时纳入已知可增强HDR的末端磷酸化及商业化 Alt-R 修饰（IDT）。实验结果显示，5′ 端单修饰对 HDR 的提升显著高于 3′ 端单修饰和 5′-3′ 双端修饰，在所有测试修饰中，5‘Cy5 表现出最高的 HDR 效率提升能力。
在此基础上，研究者进一步探索5‘Cy5-ssODN在诱导多能干细胞（iPSC）上矫正疾病相关突变的效率。结果表明，该方法可显著提高包括对镰状细胞病相关HBB基因突变的精准修复，并且经5‘Cy5-ssODN编辑的细胞存活率提高了2～3倍。更重要的是，该策略在复杂的三维细胞模型中同样表现出良好效果。例如，在人类心脏类器官中，5′Cy5修饰的ssODN显著提高了心肌细胞的精准编辑比例，同时不影响类器官的正常搏动功能。在人类类囊胚（由原始态多能干细胞在体外构建的早期胚胎样模型）中，该方法实现了近30%的HBB致病突变校正率，约为未修饰ssODN的2.5倍，同时保持了类囊胚的正常形态、细胞谱系组成及着床样发育潜能。
Cy5是一种广泛应用于生物医学研究的远红色荧光染料，通常作为荧光标签用于追踪DNA、蛋白质等生物分子。然而，本研究揭示了一个出人意料的现象：当Cy5修饰于ssODN供体模板的5′端时，它不仅发挥标记作用，还会显著改变修复模板在细胞内的行为。
研究发现，5′Cy5修饰显著提高了ssODN在细胞内的稳定性及其在细胞核中的可利用性。分子动力学模拟进一步表明，5′Cy5能够促进ssODN形成更为紧凑的类环状单链DNA构象，并增强供体DNA与靶序列之间的相互作用。此外，5′Cy5-ssODN所介导的HDR效率提升，还与编辑后细胞中DNA修复相关基因的上调，以及其与连接组蛋白H1.0更强的结合能力有关。与5′Cy5-ssODN组相比，未修饰ssODN组的细胞凋亡通路相关基因显著上调。上述综合特征使得5‘Cy5-ssODN在HDR效率方面和细胞兼容性方便均显著优于维修室ssODN和环状单链DNA。
该研究的通讯作者李墨教授表示：“如何兼顾精准基因编辑的高效率与安全性，仍是该领域面临的重大挑战。我们的研究表明，即使只对供体DNA进行微小的化学修饰，也可能对细胞内的基因组修复过程产生显著影响。” 论文共同第一作者袁保磊博士(现任同济大学副教授)指出：“5‘Cy5-ssODN能够在多种干细胞模型上高效精准地矫正疾病相关基因突变（如镰状细胞病相关基因HBB），且表现出良好的细胞兼容性。这使得该策略在基因治疗领域展现出广阔的应用前景。”


论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-73901-8
制版人： 十一
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